Смутные годы с их политической растерянностью и борьбой сначала задели хотя маленьким краем и Толгскую обитель, а потом разразились над ней тяжким бедствием, выразившемся в полном разорении монастыря. 18 мая 1609 года Толгский монастырь подвергся жестокому испытанию — отряд поляков захватил обитель, осквернил и разграбил ее. Сорок шесть иноков, скрывшихся в храме, были перебиты. Их братскую могилу долгое время отмечал «раздвоенный» камень, и богомольцы брали сквозь его отверстие могильную землю, веруя, что она обладает целебной силой. В 1893 году над местом захоронения иноков была сооружена часовня по проекту архитектора Н. И. Поздеева. В 1911 году ее интерьер украсили стенным письмом. В дни празднования 600-летия Толгского монастыря в 1914 году ее торжественно освятили как храм-часовню. Ежегодно 18 мая здесь совершалась заупокойная лития по погибшим.

В смутные дни польского нашествия икона Толгской Богоматери хранилась вне стен монастыря. Со временем икона приобретала статус первой среди чтимых икон Ярославля, к ее помощи в трудные времена прибегали и ярославцы, и жители окрестных мест, и многочисленные паломники. История сохранила нам несколько случаев, когда святая Толгская икона приносима была в Ярославль, и каждый раз принесение ее сопровождалось поразительными проявлениями милости Божией к городу.

Как рассказывают местные предания, в 1612 году в Ярославле, ставшем местом сбора народных сил в ополчение Козьмы Минина и Дмитрия Пожарского, произошло моровое поветрие. И тогда с иконой Толгской Богоматери и другими святынями города совершился первый из известных в Ярославле чрезвычайных крестных ходов, после которого болезнь отступила.

В 1657 году новое бедствие постигло город и его окрестности — сильнейшая двухмесячная засуха, когда «люди сетоваху, зверие рыкаху, скотие скорбяху, и злаком земля изсыхаше». Снова жители города обратились за помощью к чудотворному образу, и, когда икону Толгской Богоматери вносили в Ярославль, «солнце сокрываше лучи свои, облацы дождь даша доволен, земля же умягчися, древеса и плоды прорастиша плод свой, трава и жито изыде, дождневного же кропления бысть сутки трои. Сему же веселяхуся людие, зверие играху, скотие скакаху».

В 1681 году в жизни Толгского монастыря произошло знаменательное событие: опальный патриарх Никон, возвращаясь по Волге из ссылки и застигнутый предсмертной болезнью в дороге, «августа 15 дня порану достигши» обитель на Толге. Когда судно пристало к берегу, патриарх в присутствии монастырской братии причастился «от руки своего духовного отца архимандрита Кириллова монастыря Никиты». Здесь патриархом учинено было духовное во Христе примирение с прежним своим недоброжелателем, архимандритом Ярославского Спасского монастыря Сергием, сосланным в сей монастырь на покаяние. Житие святейшего патриарха Никона рассказывает об этом так: «Той Сергий, видев блаженнаго, яко уже близ к смерти сущ, припаде к ногам его со слезами умиления глаголы вещая и рече: «прости мя, святче Божий, яко паче всех сих, иже поношение на тя поняли, досаждение творил, и поношение и всяку злобу святыни твоей во время изгнания твоего повинен ти аз, собору всем угодная творя». После этого Сергий рассказал, что когда он сегодня после литургии и трапезы лег немного уснуть, явился ему во сне святейший патриарх Никон со словами: «брате Сергие! Возстани сотворим прощение», и абие у кельи моей, рассказывал Сергий, страж монастырский нача толцати, глаголя, яко шествует Волгою святейший Никон патриарх, и уже близ монастыря. Игумен и братия пошли в сретение ему, аз же сие видев и от стража слышав, притрепетен быв и ужасеся, воста и едва прииде в себе и тече скоро во след братии и прииде семо к твоей, Владыко, святыни», и абие прощение от блаженнаго оный Сергий ту получи и виденное сам пред всеми поведа. В этот же день, во время вечерни, блаженный патриарх Никон скончался в своем струге в Ярославле, на реке Которости, против Спасо-Преображенского монастыря, искренне оплакиваемый всеми жителями Ярославля.